关于ChIP-Seq
染色质免疫共沉淀（ChromatinImmunopreciption，ChIP）是研究蛋白质-DNA相互作用的经典实验方法，ChIP 与高通量测序的结合（ChIP-Seq）可以在全基因组范围内对蛋白质结合位点进行高效而准确地筛选与鉴定，广泛应用于组蛋白修饰、转录因子调控等相关领域的研究。
但是在现实中经常会收到咨询ChIP具体实验设计和操作的技术咨询。今天科技君就整理出一些在做ChIP实验中困扰老师和同学们的共性问题，制成以下这篇ChIP-Seq实验“干货帖”。
通常每个公司的抗体说明都标有级别（grade），ChIP级。如果没有，通常的规则是ChIP-PCR分析阳性control是阴性control的5倍以上的抗体认为是到达了ChIP级。
表达的表位标记的蛋白也可以。最经常使用的标签包括HA，Flag，Myc和V5。除了表位的抗体，所述靶蛋白也可以标记有生物素受体序列，其可以与生物素经由生物素连接酶在体内或体外进行标记。
10^6到10^7个细胞才能保证最终得到10到100ng ChIPed DNA。一般10^6可以满足高丰度蛋白（如RNA polymerase II）和局部组蛋白修饰（如H3K4me3）的ChIP。如果是低丰度的转录因子蛋白和其他组蛋白修饰则需要10^7个细胞。
关于control是问得最多，也是最困惑的一个问题。
不推荐IgG，原因是：第一，大多数的IgG抗体不是来源于转录因子或特定组蛋白抗体同一动物的免疫前血清。第二，IgG通常pull down非常少的DNA，这样导致在后期的建库过程中PCR Cycles 数增加，导致不能达到作为control去除背景噪音的目的（会缺失和放大部分信息）。
因此比较而言，Input更适合作为control。首先Input的建库量够，这样建库过程不需要over-amplifed，bias小。其次，最后测序得到的数据更均匀，以及全基因组覆盖度会更好。有人提到deletion 或者 RNAi knockdown目标转录因子的细胞同时做ChIP-Seq作为control更好。
有人建议需要生物重复，但是从目前我经历的项目来看，生物重复性不太好。还有人推荐用不同公司的抗体来做生物重复，这就需要考虑到经费的问题。
超声没有什么特别的，需要注意的是超声处理在含有SDS的缓冲液中可能会破坏蛋白质－蛋白质和蛋白质－DNA相互作用。但是含有SDS的缓冲液能增加超声的效率，适应与DNA紧密结合的转录因子的ChIP-Seq。最近遇到一个老师，他的项目是一个转录因子跟不同的Parters蛋白结合，再binding到相关的区域，行使调控功能。这种情况就不建议用含有SDS的缓冲液了。
这里还提些数据分析过程中需要注意的问题。需要多少数据量？大部分人认为20 Mb 是个比较适合选择。
Call peak不同软件各有优势。
Peak 类型 | 适合项目 | 工具 |
大（Broad） | 组蛋白 | CCAT,SICER |
小（Sharp） | 转录因子 | MACS |
大和小（Sharp&Broad） | ZINBA |
需要注意的是重复区域的peaks可能被忽视，原因是在前期的数据处理过程中，mapped到不同位置的reads被丢掉，而这些reads大部分是因为比对到重复区域。
另外一个问题是怎么比较不同细胞和不同条件下ChIP后测序得到的数据。ChIP条件的不同，背景噪音也不同，加上测序系统误差，所以需要均一（normalization）的软件在样本比较前对数据进行预处理。最近有个工具DIME可以处理这个问题。
以上就是做ChIP-Sep经常会遇到的一些共性问题，希望这篇技术贴对正在忙活着的小伙伴们有所帮助。
参考文章：
Benjamin L. Kidder, Gangqing Hu1, Keji Zhao, etal,ChIP-Seq: Technical Considerations for Obtaining High Quality Data.NatImmunol . ; 12(10): 918–922. doi:10.1038/ni.2117.
